una promettente alternativa sostenibile ai prodotti fitosanitari

La viticoltura moderna si trova ad affrontare una sfida cruciale: garantire produzioni di qualità riducendo l’impatto ambientale e tutelando la salute dei consumatori. L’impiego massiccio di prodotti fitosanitari, sebbene necessario per prevenire malattie e salvaguardare le rese produttive, comporta conseguenze negative sull’ambiente e sulla qualità del prodotto finale. La direttiva europea 128/2009 e la strategia “Farm to Fork” hanno fissato obiettivi ambiziosi per la riduzione dell’uso di pesticidi chimici, stimolando la ricerca di soluzioni alternative.

Tra queste, l’utilizzo di microrganismi endofiti come agenti di biocontrollo sta suscitando un interesse crescente. Gli endofiti sono microrganismi che vivono all’interno dei tessuti vegetali senza causare danni apparenti alla pianta ospite, instaurando con essa relazioni spesso mutualistiche. La loro capacità di produrre metaboliti secondari con attività antimicrobica, competere per lo spazio e i nutrienti, e stimolare le difese della pianta li rende candidati ideali per la protezione sostenibile delle colture.

Lo studio pubblicato su Frontiers in Microbiology ha preso in esame 42 isolati endofiti provenienti da viti di diverse regioni del Nord Italia, selezionando quelli in grado di contrastare efficacemente Botrytis cinerea, l’agente eziologico della muffa grigia, una delle malattie più dannose per la vite. I ricercatori hanno adottato un approccio multidisciplinare che combina saggi di antagonismo in vitro, analisi dei composti organici volatili, test di tolleranza a sostanze chimiche e studi di interazione con la pianta ospite.

Selezione degli agenti di biocontrollo e meccanismi d’azione

Il processo di selezione ha identificato sei ceppi con significativa attività antagonistica: quattro appartenenti alla specie Aureobasidium pullulans (ED203, ED206, ED217, ED221) e due a Bacillus velezensis (ED163, ED219). I saggi di coltura duale, che permettono il contatto diretto tra i microrganismi, hanno rivelato che B. velezensis ED163 possiede la più elevata capacità inibitoria, con una riduzione della crescita del patogeno pari al 66,6%. I ceppi di A. pullulans hanno mostrato percentuali di inibizione comprese tra il 58,9% e il 64,0%.

Per comprendere i meccanismi alla base di questa attività antagonistica, i ricercatori hanno impiegato il saggio della doppia piastra, che impedisce il contatto fisico tra i microrganismi ma consente lo scambio di composti volatili. In questo contesto, A. pullulans ED221 e ED203 hanno evidenziato le migliori performance, con inibizioni rispettivamente del 47,2% e 37,7%, suggerendo che la produzione di composti organici volatili (VOCs) rappresenta un meccanismo d’azione particolarmente efficace per questi lieviti.

L’analisi dei profili volatili mediante gascromatografia-spettrometria di massa ha permesso di identificare tre distinti cluster metabolici tra i ceppi esaminati. Il primo gruppo, comprendente ED206 e ED221, produce prevalentemente alcoli e composti aromatici come 1-esanolo, indolo e β-damascenone. Il secondo cluster, costituito da ED217 e ED163, si caratterizza per la produzione di esteri, alcoli e terpeni, tra cui acetato di etile, alcol feniletilico e sabinene. Il terzo gruppo, rappresentato dal ceppo ED203, produce principalmente chetoni e idrocarburi come 2-eptanone e 2-nonanone. Questa diversità metabolica suggerisce che differenti ceppi possano adottare strategie complementari per inibire la crescita del patogeno.

Tra i composti identificati, particolare interesse riveste il sabinene, un monoterpene con note proprietà antifungine, prodotto dal ceppo ED221. La sua presenza potrebbe derivare sia dalla sintesi microbica diretta sia da una risposta metabolica della pianta stimolata dall’endofita. Analogamente, composti come 2-butanone, 3-idrossi e 2-feniletanolo, prodotti da B. velezensis, sono già noti per la loro attività antimicrobica e sono stati precedentemente associati all’antagonismo verso patogeni fungini.

Un aspetto particolarmente interessante emerso dall’analisi dei VOCs riguarda i composti rilevati esclusivamente durante l’interazione tra il patogeno e gli agenti di biocontrollo. Sostanze come 2-eptanolo, 2-furanmetanolo e 2-pentene, 5-butossi, (E), assenti nelle colture pure dei singoli microrganismi, compaiono quando B. cinerea viene co-coltivata con i ceppi antagonisti, indicando che l’interazione microbica induce una modulazione del metabolismo volatile che potrebbe contribuire all’effetto inibitorio.

Tolleranza ai trattamenti chimici e compatibilità applicativa

Un aspetto cruciale per l’impiego pratico degli agenti di biocontrollo riguarda la loro compatibilità con i trattamenti chimici tradizionalmente impiegati in viticoltura. Lo studio ha valutato la tolleranza dei ceppi selezionati nei confronti del rame, del fungicida commerciale SWITCH e dell’anidride solforosa, considerando le diverse fasi del processo produttivo.

Per quanto riguarda il rame, ancora ampiamente utilizzato per il controllo della peronospora, i risultati mostrano una marcata differenza tra le specie. I ceppi di A. pullulans hanno dimostrato una buona tolleranza, con crescita osservata fino a concentrazioni di 100 mg/L per ED203 e ED219, e fino a 64 mg/L per ED217, ED206 ed ED221. Al contrario, B. velezensis ED163 si è rivelato estremamente sensibile, con completa inibizione della crescita già alla concentrazione più bassa testata (20 mg/L). Questa sensibilità potrebbe rappresentare un fattore limitante per l’impiego di questo batterio in vigneti dove i trattamenti rameici sono ancora praticati.

Il fungicida SWITCH, contenente ciprodinil e fludioxonil, è risultato ben tollerato da tutti i ceppi di A. pullulans fino alla concentrazione di 1 g/L, mentre B. velezensis ED163 ha mostrato crescita solo in assenza del prodotto. Questa sensibilità ai fungicidi commerciali, unita a quella verso il rame, suggerisce che l’impiego di B. velezensis in strategie integrate potrebbe essere limitato, pur rimanendo valido in contesti a basso input chimico.

La situazione si ribalta completamente quando si valuta la sensibilità all’anidride solforosa, il principale antimicrobico utilizzato in enologia. Tutti i ceppi testati hanno mostrato una drastica riduzione della vitalità in presenza di 50 mg/L di SO2, il dosaggio standard per i trattamenti prefermentativi. Questa sensibilità rappresenta in realtà un vantaggio dal punto di vista enologico, poiché garantisce che gli agenti di biocontrollo eventualmente presenti sulle uve al momento della raccolta vengano efficacemente eliminati, evitando interferenze con i processi fermentativi. I lieviti A. pullulans, in particolare, hanno evidenziato una crescita significativa a pH 3,5 in assenza di SO2, ma una sopravvivenza inferiore a 10 UFC/mL in presenza del conservante.

Attività in vivo e interazione con la pianta ospite

Per validare i risultati ottenuti in laboratorio in condizioni più realistiche, i ricercatori hanno condotto saggi in vivo su dischi fogliari di vite cv. Merlot. I ceppi selezionati sono stati applicati sulle foglie prima dell’inoculazione del patogeno, valutando successivamente l’estensione dell’area necrotica. Sebbene i risultati abbiano mostrato una variabilità tra le repliche, attribuibile alla complessità del sistema biologico, è emersa una chiara tendenza alla riduzione del danno nei campioni trattati con gli agenti di biocontrollo.

In particolare, i ceppi ED203 e ED221 di A. pullulans hanno determinato una riduzione statisticamente significativa della necrosi rispetto al controllo positivo infettato solo con B. cinerea. Questi risultati confermano il potenziale dei lieviti endofiti non solo in condizioni di laboratorio, ma anche su tessuto vegetale integro, avvicinando la ricerca a scenari applicativi realistici.

Per approfondire i meccanismi di interazione tra agente di biocontrollo, patogeno e pianta ospite, il team ha sviluppato un sistema sperimentale innovativo utilizzando colture cellulari di Vitis sylvestris, l’antenato selvatico della vite coltivata. Questo sistema, più semplice e riproducibile rispetto alla pianta intera, consente di studiare le interazioni a livello cellulare e molecolare in condizioni controllate.

Le osservazioni al microscopio elettronico a scansione hanno rivelato dettagli affascinanti delle interazioni microbiche sulla superficie delle cellule vegetali. Nelle colture infettate solo con B. cinerea, le spore del patogeno germinavano attivamente, producendo ife che colonizzavano estesamente la superficie cellulare. Al contrario, nelle colture co-coltivate con B. velezensis ED163, la crescita fungina risultava marcatamente limitata. Il batterio formava una sorta di patina o biofilm sulla superficie delle cellule di Vitis, riducendo la capacità di adesione e germinazione delle spore del patogeno. Questo meccanismo di competizione spaziale, già ipotizzato in studi precedenti, trova qui una conferma visiva diretta, suggerendo che la formazione di biofilm rappresenti una strategia chiave per il controllo biologico.

Attivazione delle difese della pianta: il ruolo della via dei fenilpropanoidi

Oltre all’effetto diretto sul patogeno, gli agenti di biocontrollo possono stimolare le difese naturali della pianta, un meccanismo noto come “induzione di resistenza”. Lo studio ha esaminato l’espressione di due geni chiave della via metabolica dei fenilpropanoidi, responsabile della sintesi di composti antimicrobici come gli stilbeni, tra cui il resveratrolo.

Il gene STS1 codifica per la stilbene sintasi, enzima chiave nella biosintesi degli stilbeni, mentre VvABCG44 è coinvolto nel trasporto del resveratrolo attraverso la membrana cellulare. L’analisi dell’espressione genica nelle colture cellulari di V. sylvestris ha rivelato una significativa sovraregolazione di STS1 in presenza di B. velezensis ED163 e del patogeno. Dopo 4 giorni di co-coltura, l’espressione di STS1 risultava aumentata di circa 25 volte rispetto al controllo infettato solo con B. cinerea B05.10, per poi attestarsi su valori 23 volte superiori a 8 giorni. Risultati analoghi, sebbene meno marcati, sono stati osservati con il ceppo UCA992 di B. cinerea, con un aumento di 9 volte a 4 giorni e 5 volte a 8 giorni.

Anche il gene VvABCG44 ha mostrato una sovraregolazione significativa, sebbene con cinetiche diverse. Nelle colture infettate con B05.10 e ED163, l’aumento dell’espressione, non significativo a 4 giorni, raggiungeva circa 9 volte il controllo a 8 giorni. Con il ceppo UCA992, invece, si osservava un aumento di 4 volte già a 4 giorni, che si manteneva stabile fino a 8 giorni.

L’analisi statistica ha confermato che la presenza dell’agente di biocontrollo influisce in modo altamente significativo sull’attivazione genica (p < 0,001), e che i due geni rispondono in modo differenziato allo stimolo (p = 0,0149). Non sono state invece osservate differenze significative tra i due tempi di campionamento (4 e 8 giorni), suggerendo che il sistema di difesa si attivi precocemente e si mantenga attivo nel tempo.

Questi risultati sono particolarmente rilevanti perché dimostrano per la prima volta che un agente di biocontrollo vivo, in combinazione con il patogeno, può elicitare efficacemente le difese della pianta in un sistema biologicamente realistico. Studi precedenti avevano ottenuto risultati simili utilizzando elicitori chimici come le ciclodestrine o il metiljasmonato, ma l’uso di microrganismi vivi rappresenta un approccio più vicino alle condizioni reali di campo e potenzialmente più sostenibile.

Prospettive applicative e sfide future

Lo studio offre un contributo significativo alla comprensione del potenziale degli endofiti come agenti di biocontrollo in viticoltura, ma evidenzia anche le sfide che attendono la loro applicazione pratica. La diversità di risposta tra i ceppi, sia in termini di attività antagonistica che di tolleranza ai trattamenti chimici, sottolinea l’importanza di una caratterizzazione approfondita per selezionare i candidati più adatti a specifici contesti produttivi.

B. velezensis ED163 emerge come il più promettente per l’attività antagonista in vitro e per la capacità di stimolare le difese della pianta, ma la sua sensibilità al rame e ai fungicidi ne limita l’impiego in strategie integrate che prevedano l’uso di questi prodotti. Al contrario, i ceppi di A. pullulans, pur mostrando un’attività antagonistica leggermente inferiore, offrono una maggiore compatibilità con i trattamenti rameici e fungicidi, risultando potenzialmente più adatti a essere integrati nei programmi di difesa convenzionali.

Un aspetto di particolare interesse è la sensibilità di tutti i ceppi all’anidride solforosa, che da un lato ne garantisce l’eliminazione durante le fasi prefermentative, evitando interferenze con la vinificazione, ma dall’altro richiede che l’applicazione in campo sia seguita da un attento monitoraggio per assicurare che l’effetto protettivo si mantenga fino alla raccolta. Sono inoltre necessari ulteriori studi per valutare la persistenza degli agenti di biocontrollo sulle uve nelle diverse condizioni climatiche e per ottimizzare le formulazioni e le modalità di applicazione.

La ricerca apre anche nuovi orizzonti per lo studio delle interazioni microbo-pianta. La dimostrazione che B. velezensis può attivare le difese della vite stimolando la via dei fenilpropanoidi suggerisce che gli agenti di biocontrollo possano agire non solo direttamente sul patogeno, ma anche potenziando le risposte immunitarie della pianta. Questo doppio meccanismo d’azione rappresenta un vantaggio significativo rispetto ai fungicidi chimici, che agiscono esclusivamente sul patogeno.

La transizione dai saggi di laboratorio alle applicazioni in campo rappresenta la prossima frontiera. Le condizioni ambientali variabili, la presenza di comunità microbiche autoctone e le interazioni con altri organismi presenti nel vigneto possono influenzare significativamente l’efficacia degli agenti di biocontrollo. Saranno quindi necessari studi di scala a livello di vigneto per validare i risultati ottenuti in condizioni controllate e sviluppare protocolli applicativi robusti.

Conclusioni

Lo studio condotto su endofiti della vite rappresenta un passo significativo verso una viticoltura più sostenibile, offrendo solide evidenze scientifiche sul potenziale di Aureobasidium pullulans e Bacillus velezensis come agenti di biocontrollo contro Botrytis cinerea. La combinazione di saggi in vitro, analisi metabolomiche, test di tolleranza e studi di interazione con la pianta ospite ha permesso di delineare un quadro completo delle potenzialità e dei limiti di questi microrganismi.

I ceppi ED203 e ED221 di A. pullulans si distinguono per l’efficacia sia in vitro che in vivo, per la tolleranza al rame e ai fungicidi, e per la produzione di composti volatili ad attività antifungina. B. velezensis ED163, pur mostrando la più elevata attività antagonistica e la capacità di stimolare le difese della pianta, presenta limiti legati alla sensibilità ai trattamenti chimici convenzionali.

La scoperta che gli agenti di biocontrollo possono attivare le vie metaboliche di difesa della pianta, in particolare la sintesi di stilbeni come il resveratrolo, aggiunge un ulteriore elemento di valore a questa strategia, suggerendo che il controllo biologico possa agire su fronti multipli: inibizione diretta del patogeno, competizione per lo spazio e i nutrienti, e potenziamento delle difese della pianta.

La strada verso l’applicazione pratica è ancora lunga e richiede ulteriori ricerche per ottimizzare le formulazioni, valutare l’efficacia in condizioni di campo e sviluppare strategie di integrazione con i trattamenti convenzionali. Tuttavia, i risultati di questo studio forniscono solide basi scientifiche per proseguire in questa direzione, contribuendo alla costruzione di un modello vitivinicolo più rispettoso dell’ambiente e della salute dei consumatori.